長(zhǎng)鏈非編碼 RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一類長(zhǎng)度在200nt以上且不編碼蛋白質(zhì)的RNA，以帶polyA尾和不帶polyA尾兩種形式廣泛存在于各種生物體內(nèi)，參與細(xì)胞內(nèi)多種過(guò)程調(diào)控，具有跨物種的低保守性，組織特異性表達(dá)和豐度低等特點(diǎn)。
       近年來(lái)的研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾和核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過(guò)程，但絕大部分lncRNA的功能目前仍不清楚。應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)，研究人員能夠快速獲得與疾病或者特定生物學(xué)過(guò)程相關(guān)的lncRNA 并進(jìn)行深入研究。

1、實(shí)驗(yàn)方案
     測(cè)序策略：Illumina 平臺(tái) PE150
     數(shù)據(jù)量：12G clean data

2、技術(shù)優(yōu)勢(shì)
（1）任意物種檢測(cè)：相對(duì)傳統(tǒng)芯片而言，無(wú)需預(yù)先設(shè)計(jì)特異性探針，因此無(wú)需了解物種基因或基因組信息，能夠直接對(duì)任何物種進(jìn)行最全面的轉(zhuǎn)錄組分析；
（2）分辨率高：可以檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本中單堿基的差異；
（3）檢測(cè)范圍廣：從幾個(gè)到數(shù)十萬(wàn)個(gè)拷貝精確計(jì)數(shù)，可同時(shí)鑒定正常和稀有的轉(zhuǎn)錄本；
（4）信息分析廣：可以做基因差異表達(dá)分析、可變剪切、融合基因分析；新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)及注釋。

3、 數(shù)據(jù)分析
3.1 標(biāo)準(zhǔn)信息分析
（1）數(shù)據(jù)過(guò)濾及質(zhì)量評(píng)估
（2）核糖體RNA去除率計(jì)算
（3）比對(duì)參考基因組及統(tǒng)計(jì)
（4）基因表達(dá)水平分析
（5）基因表達(dá)差異及聚類分析
（6）差異基因KEGG生物通路富集分析（僅限于模式物種）
（7）差異基因GO功能富集分析（僅限于模式物種）
（8）已知mRNA表達(dá)量分析
（9）已知mRNA差異表達(dá)及聚類分析
（10）已知lncRNA表達(dá)量分析
（11）已知lncRNA差異表達(dá)及聚類分析
（12）預(yù)測(cè)新lncRNA
（13）新lncRNA鑒定和表達(dá)量分析
（14）新lncRNA差異表達(dá)及聚類分析
（15）新lncRNA家族分析
（16）SNP和InDel檢測(cè)與注釋
（17）生物學(xué)重復(fù)樣品間相關(guān)性分析
（18）蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析
（19）基因融合
（20）主成份分析（PCA）
（21）特征性差異表達(dá)基因分析
（22）lncRNA保守性分析
（23）可變剪切
3.2 高級(jí)分析
（1）已知mRNA-lncRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
（2）基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化及優(yōu)化基因的表達(dá)值計(jì)算 
（3）eQTL分析

4、技術(shù)流程


5、案例分析
       案例（1）瘦豬和肥胖豬組織中l(wèi)ncRNA的表達(dá)水平不同
       該研究對(duì)豬的兩個(gè)品種陸川和杜洛克的肝臟、肌肉和脂肪組織分別進(jìn)行了lncRNA測(cè)序，共鑒定出4868個(gè)lncRNA轉(zhuǎn)錄本，其中3235個(gè)為新轉(zhuǎn)錄本，而且lncRNA和mRNA的表達(dá)模式是組織特異性的。脂肪組織中差異表達(dá)的lncRNA具有794個(gè)潛在的靶基因，這些靶基因富集到脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、PI3k-Akt信號(hào)通路和鈣離子信號(hào)通路。此外，差異表達(dá)的lncRNA位于13個(gè)脂肪相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)，其中包括65個(gè)QTL_ID。接著，分析了同一QTL_ID中的lncRNA和mRNA，并通過(guò)qPCR證實(shí)了其在兩個(gè)QTL_ID中的共表達(dá)。該研究為兩個(gè)豬品種脂肪代謝差異的分子機(jī)理提供了新的觀點(diǎn)，為進(jìn)一步研究lncRNA在肥胖發(fā)育中的調(diào)控作用奠定了重要基礎(chǔ)。

圖1 組織中l(wèi)ncRNA和mRNA的差異表達(dá)
 

圖2 lncRNA和mRNA差異表達(dá)的熱圖

       案例（2）長(zhǎng)非編碼RNA控制造血干細(xì)胞功能
       造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）具有獨(dú)特的基因表達(dá)程序，能夠自我更新和分化成各類成熟血細(xì)胞。長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）已成為基因表達(dá)和細(xì)胞命運(yùn)決定的重要調(diào)節(jié)因子，盡管它們?cè)贖SC中的功能尚不清楚。該研究對(duì)純化的HSC進(jìn)行l(wèi)ncRNA測(cè)序，鑒定出323個(gè)未注釋的lncRNA。比較這些lncRNA在差異譜系中的表達(dá)顯示159個(gè)lncRNA富集于HSC，其中一些可能是是HSC特異性的（LncHSC）。這些lncRNA基因與編碼蛋白基因具有相似的表觀遺傳學(xué)特征，如通過(guò)DNA甲基化調(diào)節(jié)表達(dá)。敲低兩種LncHSC對(duì)HSC自我更新和譜系定型產(chǎn)生了的不同影響。該研究結(jié)果表明，lncRNA在HSC調(diào)控中起重要作用，為HSC調(diào)控的遺傳回路提供了一個(gè)新的思路。

圖1 HSC特異的lncRNA的鑒定

參考文獻(xiàn)
[1] Yu et al. Comparative analyses of long non-coding RNA in lean and obese pig. Oncotarget, 2017.
[2] Luo et al. Long non-coding RNAs control hematopoietic stem cell function. Cell Stem Cell, 2015.

LncRNA測(cè)序,LncRNA測(cè)序

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