RRBS測(cè)序 服務(wù)簡(jiǎn)介

       Reduced Representation Bisulfite Sequencing（RRBS）是一種準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)的DNA甲基化研究方法，通過MspI酶識(shí)別CCGG酶切位點(diǎn)處理DNA，富集啟動(dòng)子及CpG島區(qū)域，并進(jìn)行 Bisulfite處理和高通量測(cè)序，同時(shí)實(shí)現(xiàn)DNA甲基化狀態(tài)檢測(cè)的高分辨率和測(cè)序數(shù)據(jù)的高利用率。DNA甲基化研究一直是疾病研究的熱點(diǎn)，與基因表達(dá)、表型性狀息息相關(guān)。 RRBS作為一種高性價(jià)比的甲基化研究方法，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。

1、實(shí)驗(yàn)方案
      測(cè)序策略：Illumina NextSeq 500或HiSeq 3000  PE150
      數(shù)據(jù)量：推薦5G clean data

2、技術(shù)優(yōu)勢(shì)
（1）精確度高：在其覆蓋范圍內(nèi)可達(dá)到單堿基分辨率，見下表；
（2）重復(fù)性好：多樣本的覆蓋區(qū)域重復(fù)性高達(dá)85%-95%，適合多樣本間的甲基化差異分析；
（3）檢測(cè)范圍廣： 覆蓋全基因組范圍內(nèi)超過5百萬個(gè)CpG位點(diǎn)；
（4）性價(jià)比高：測(cè)序區(qū)域更有針對(duì)性，數(shù)據(jù)利用率更高。

表1 三種甲基化研究技術(shù)比較

甲基化研究方法Bisulfite-SeqRRBSMeDIP-Seq覆蓋范圍全基因組主要集中在CpG島和promoter區(qū)域全基因組范圍，但是傾向于高CpG密度和高甲基化區(qū)域原理Bisulfite處理酶切+Bisulfite處理抗體富集分辨率1bp1bp100-1000bp數(shù)據(jù)量≥30X 基因組3G、5G4G鑒定MDR的數(shù)量多多少DMRs的靈敏度高高低插入片段長(zhǎng)度200-300 bp40-220 bp200-300 bp價(jià)格昂貴便宜便宜

3、數(shù)據(jù)分析
3.1 標(biāo)準(zhǔn)信息分析
（1）去接頭污染，去低質(zhì)量reads和產(chǎn)量情況統(tǒng)計(jì)； 
（2）RRBS序列與參考序列的比對(duì)； 
（3）Promoter和CGI（CpG island）覆蓋度分析；
（4）Promoter和CGI區(qū)的甲基化分析：
（5）甲基化C堿基中CG，CHG 與CHH 的分布比例；
（6）甲基化C的平均甲基化水平； 
（7）不同C堿基類型（CG,CHG,CHH）甲基化水平的分布； 
（8）區(qū)域甲基化圖譜；   
（9）差異甲基化區(qū)域（DMR）的分析。
3.2 高級(jí)信息分析
     根據(jù)客戶的具體研究進(jìn)行的個(gè)性化分析

4、技術(shù)流程


RRBS測(cè)序 案例分析

       案例（1）UHRF家族蛋白過表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞DNA低甲基化
       細(xì)胞DNA低甲基化是腫瘤中最常見的表觀改變，但機(jī)理不明。研究表明UHRF1調(diào)停DNMT1甲基化后的DNA修復(fù)。通過RRBS技術(shù)，報(bào)道UHRF1和UFRF2可以行使E3連接酶功能，促進(jìn)DNMT3A降解以阻止DNA甲基化的從頭合成過程。UHRF1/2通常在腫瘤中呈現(xiàn)過表達(dá)，研究表明UHRF1/2過表達(dá)抑制了DNMT3A蛋白合成進(jìn)而導(dǎo)致DNA低甲基化。如果廢止對(duì)DNMT3A的下調(diào)作用或者促使DNMT3A的過表達(dá)，則會(huì)直接引起DNA甲基化并使得腫瘤生長(zhǎng)受損。該研究提出一種工作模型：UHRF1/2守衛(wèi)DNA甲基化的保真度，通過UHRF1/2過表達(dá)抑制DNMT2A進(jìn)而引起腫瘤中DNA低甲基化的一個(gè)因子。

 圖1 UHRF2通過負(fù)調(diào)控DNA甲基化的從頭合成進(jìn)而抑制DNA甲基化



 圖2  腫瘤中UHRF1/2過表達(dá)與DNMT3A蛋白下調(diào)的關(guān)系分析
        案例（2）人中性粒細(xì)胞基因組DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組譜
       DNA分子甲基化是一種與人類疾病、基因表達(dá)和表型變化相關(guān)的重要機(jī)理。利用RRBS技術(shù)，新西蘭研究人員分析出在健康個(gè)體中DNA的甲基化模式，同時(shí)識(shí)別了表現(xiàn)出顯著個(gè)體化差異的基因。研究人員使用illumina GAII和Hiseq2000平臺(tái)對(duì)13個(gè)樣本進(jìn)行RRBS測(cè)序，共得到633 M條100bp讀長(zhǎng)的數(shù)據(jù)。進(jìn)一步使用illumina HiSeq2000平臺(tái)對(duì)其中四個(gè)樣本進(jìn)行RNA-Seq，獲得174M 條51bp讀長(zhǎng)的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。目前的數(shù)據(jù)集合可以為一個(gè)綜合資源利用，以了解在健康個(gè)體中表型性狀、DNA甲基化導(dǎo)致的疾病易感性以及基因表達(dá)模式的本質(zhì)和機(jī)理。

圖1 RRBS測(cè)序reads的特征和質(zhì)量
參考文獻(xiàn)
[1] Jia et al. Negative regulation of DNMT3A de novo DNA methylation by frequently overexpressed UHRF family proteins as a mechanism for widespread DNA hypomethylation in cancer.Cell Discovery, 2016.
[2] Chatterjee et al. Genome-scale DNA methylome and transcriptome profiling of human neutrophils. Scientific Data, 2016.

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