CLIP- Seq，即紫外交聯(lián)免疫沉淀結(jié)合高通量測(cè)序（crosslinking-immunoprecipitation and high-throughput sequencing），是一項(xiàng)在全基因組水平揭示RNA分子與RNA結(jié)合蛋白相互作用的革命性技術(shù)。該技術(shù)主要原理是基于RNA分子與RNA結(jié)合蛋白在紫外照射下發(fā)生耦聯(lián)，以RNA結(jié)合蛋白的特異性抗體將RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體沉淀之后，回收其中的RNA片段，經(jīng)添加接頭、RT-PCR等步驟，再對(duì)這些分子進(jìn)行高通量測(cè)序和生物信息學(xué)的分析，從而深入揭示RNA結(jié)合蛋白與RNA分子的調(diào)控作用及其對(duì)生命的意義。
       最近幾年，這項(xiàng)技術(shù)也被應(yīng)用到miRNA靶標(biāo)鑒定等工作中。在動(dòng)物體內(nèi)，成熟的單鏈miRNA與一系列蛋白形成miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC），結(jié)合于靶mRNA的3"-UTR 區(qū)，阻止所結(jié)合的mRNA的翻譯或直接降解靶miRNA?；谶@一原理，我們可以通過(guò)CLIPSeq技術(shù)來(lái)進(jìn)行mRNA靶基因的篩選。CLIP-Seq方法的應(yīng)用能夠非常明顯地降低miRNA結(jié)合位點(diǎn)的假陽(yáng)性預(yù)測(cè)頻率，并且減小miRNA結(jié)合位點(diǎn)搜尋空間的范圍，可以在全基因組范圍內(nèi)鑒定AGO2蛋白在不同RNA上的結(jié)合位點(diǎn)。

1、實(shí)驗(yàn)方案
      測(cè)序策略：Illumina平臺(tái) SE50
      數(shù)據(jù)量：20M clean reads

2、技術(shù)優(yōu)勢(shì)
（1）全轉(zhuǎn)錄組覆蓋：與CLIP芯片相比，可在全轉(zhuǎn)錄組范圍對(duì)蛋白結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行篩選與鑒定；
（2）高靈敏度：每個(gè)樣本可獲得數(shù)百萬(wàn)條的序列標(biāo)簽，可發(fā)現(xiàn)研究轉(zhuǎn)錄組上稀有的蛋白結(jié)合位點(diǎn)；
（3）準(zhǔn)確性高： 從活細(xì)胞交聯(lián)開(kāi)始，反應(yīng)了體內(nèi)環(huán)境下真實(shí)的分子間相互作用；
（4）特異性強(qiáng)： 紫外輻射不會(huì)造成蛋白和蛋白之間的交聯(lián)，只會(huì)鑒定出蛋白和 RNA 之間的相互作用；
（4）應(yīng)用范圍廣： 特別適用于研究剪接因子RNA結(jié)合圖譜、miRNA作用靶點(diǎn)等研究。

3、數(shù)據(jù)分析
（1）將reads比對(duì)到基因組：將預(yù)處理reads與reference genome進(jìn)行mapping，最后得到mapping的sam結(jié)果文件，給出mapping結(jié)果統(tǒng)計(jì)；
（2）peak detect：應(yīng)用sam文件進(jìn)行peak富集區(qū)查找；
（3）motif detect：查找結(jié)合位點(diǎn)區(qū)結(jié)構(gòu)特性，尋找轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域的motif結(jié)構(gòu)；
（4）基因關(guān)聯(lián)：應(yīng)用結(jié)合位點(diǎn)區(qū)位置，確定其周?chē)婕暗幕颍?br style="" class="">（5）關(guān)聯(lián)基因GO差異分析：以參考基因組為背景集對(duì)結(jié)合位點(diǎn)關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行GO富集分析。

4、技術(shù)流程


5、案例分析
       案例（1）依賴(lài)SIRT7去乙?；腢3-55K蛋白控制的rRNA前體加工
        SIRT7是一種NAD+依賴(lài)蛋白脫乙酰酶，在核糖體合成及細(xì)胞增殖中具有重要作用。以往的研究已經(jīng)證實(shí)SIRT7與RNA聚合酶I 相關(guān)聯(lián)，它與pre-rRNA相互作用促進(jìn)rRNA合成。德國(guó)腫瘤研究中心小組成員通過(guò)研究表明SIRT7也與小核仁RNP相關(guān)聯(lián)，參與pre-rRNA的加工和rRNA的成熟，實(shí)驗(yàn)通過(guò)將標(biāo)記的SIRT7從紫外交聯(lián)的HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行免疫沉淀，然后獲取沉淀RNA進(jìn)行測(cè)序，最后進(jìn)行序列分析。敲除SIRT7會(huì)損害依賴(lài)U3 snoRNA的早期斷裂步驟，而這一步對(duì)18sRNAde 生成是必不可少的。從機(jī)制上來(lái)看，SIRT7脫去乙?；鵘3-55k，它是U3 snoRNA復(fù)合物的一個(gè)核心成分，這個(gè)可逆的乙?；饔谜{(diào)節(jié)U3-55k與U3 snoRNA的結(jié)合。SIRT7的脫乙酰作用促進(jìn)U3-55k與U3 snoRNA的結(jié)合，是pre-rRNA進(jìn)行加工的先決條件。在壓力條件下，SIRT7從核仁被釋放，導(dǎo)致U3-55k高度乙?；瑴p弱pre-rRNA的加工。結(jié)果顯示SIRT7在核糖體合成中具有多種作用，調(diào)節(jié)rRNA的轉(zhuǎn)錄和加工。

圖1 SIRT7與pre-rRNA和snoRNA關(guān)系圖
       案例（2） ALS相關(guān)蛋白TDP-43、FUS和TAF15功能的異同
       肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種以運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、腦干和脊椎漸進(jìn)性退化為特點(diǎn)的絕癥。本研究展示了RNA代謝過(guò)程中FUS、TAF15和TDP-43的功能異同。RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding protein，RBP）TAF15、FUS和TDP-43與ALS有關(guān)。為了比較三個(gè)RBP的功能差異，本文運(yùn)用CLIP-Seq和RNA Bind-N-Seq技術(shù)對(duì)成年小鼠腦進(jìn)行研究，揭示TAF15可富集得到約4900條含有GGUA基序的RNA。TAF15與FUS在內(nèi)含子中表現(xiàn)出相似的結(jié)合模式。但是不同于FUS和TDP-43，TAF15在差異性剪切中僅起到微小的作用。在人的神經(jīng)祖細(xì)胞中，TAF15和FUS會(huì)影響靶RNA的穩(wěn)定性。源自人干細(xì)胞分化得到的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞中，TAF15和FUS同時(shí)缺失的RNA圖譜與ALS患者纖維母細(xì)胞中FUS R521G突變展現(xiàn)出相似的結(jié)果。

圖1 TAF15對(duì)一個(gè)轉(zhuǎn)錄本小子集差異性剪切的影響
參考文獻(xiàn)
[1] Chen et al. SIRT7-dependent deacetylation of the U3-55k protein controls pre-rRNA processing.Nature Communications, 2016.
[2] Kapeli et al. Distinct and shared functions of ALS-associated proteins TDP-43, FUS and TAF15 revealed by multisystem analyses. Nature Communications, 2016.

CLIP- Seq,CLIP- Seq

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