miRNA是一類高度保守的小RNA分子，它可以參與基因表達(dá)與調(diào)控、RNA的加工與剪切、蛋白質(zhì)翻譯、遺傳“入侵”抑制、配子發(fā)生等重要生物學(xué)過(guò)程，是生命活動(dòng)中必不可少的調(diào)控因子。miRNA測(cè)序技術(shù)采用膠分離技術(shù)，收集樣本中18-30nt的RNA片段，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本中所有small RNA家族進(jìn)行測(cè)序和表達(dá)定量，從而解析miRNA 、siRNA 、piRNA 其它非編碼RNA等序列，并預(yù)測(cè)新的小RNA及其靶基因。

1、實(shí)驗(yàn)方案
      測(cè)序策略：Illumina 平臺(tái) SE50
      數(shù)據(jù)量：10M clean reads

2、技術(shù)優(yōu)勢(shì)
（1）通量高：一次測(cè)序得到上千萬(wàn)條序列；
（2）分辨率高：可以檢測(cè)小RNA單個(gè)堿基的差異；
（3）精準(zhǔn)度高：從幾個(gè)到幾十萬(wàn)個(gè)拷貝精確計(jì)數(shù)；
（4）可重復(fù)性好：深度測(cè)序保證了抽樣隨機(jī)性，重復(fù)性好，無(wú)需重復(fù)實(shí)驗(yàn)；
（5）檢測(cè)范圍廣：既能鑒定已知小RNA，又能發(fā)現(xiàn)新的小RNA。

3、信息分析
3.1 標(biāo)準(zhǔn)信息分析
（1）按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估；
（2）樣品間的公共序列和特異序列分析；
（3）小RNA與參考基因組比對(duì)分析；
（4）按照優(yōu)先級(jí)將小RNA進(jìn)行分類注釋
（5）Novel Small RNA預(yù)測(cè)；
（6）樣本間miRNA差異表達(dá)分析；
（7）已知miRNA的家族分析；
（8）已知miRNA差異分析（≥2個(gè)樣本）和聚類分析（≥3個(gè)樣本）；
（9）已知miRNA和novel miRNA的靶基因預(yù)測(cè)；
（10）已知miRNA和novel miRNA的靶基因GO注釋和KEGG通路分析；
（11）novel miRNA差異分析（≥2個(gè)樣本）和聚類分析（≥3個(gè)樣本）；
（12）差異miRNA靶基因預(yù)測(cè)；
（13）已知miRNA的堿基編輯分析；
3.2 高級(jí)信息分析
（1）snoRNA注釋
（2）piRNA注釋
（3）mir2disease注釋

4、技術(shù)流程


5、案例分析
       案例（1）小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中小RNA的動(dòng)態(tài)變化及其生物學(xué)功能
       該研究利用優(yōu)化的方法系統(tǒng)解析了小鼠卵子到受精后8細(xì)胞胚胎發(fā)育過(guò)程中的小RNA動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)小鼠卵子和早期胚胎主要包含三類小RNA：endo-siRNA、piRNA和miRNA。受精卵中的這三類小RNA絕大多數(shù)來(lái)源于卵子，由精子帶入卵子的小RNA不足幾百分之一。隨著胚胎的發(fā)育，母源endo-siRNA和piRNA逐漸被緩慢降解。而母源miRNA的降解較快，主要發(fā)生在胚胎2細(xì)胞期前后。合子中新表達(dá)的miRNA最早出現(xiàn)在受精卵第一次分裂前，并隨著胚胎的發(fā)育持續(xù)被激活表達(dá)，特別是進(jìn)化保守的miRNA的表達(dá)量迅速上升。研究人員進(jìn)一步結(jié)合小鼠早期胚胎發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miRNA在卵子到胚胎2細(xì)胞期中幾乎沒(méi)有降解靶基因mRNA的功能，而在4-8細(xì)胞期中miRNA降解靶基因mRNA的功能開始逐步恢復(fù)，并對(duì)合子激活表達(dá)的基因有明顯的靶向抑制作用。以上研究不僅揭示了小鼠早期胚胎發(fā)育中miRNA的表達(dá)和降解規(guī)律，還發(fā)現(xiàn)了miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控活性隨著胚胎發(fā)育而被動(dòng)態(tài)調(diào)控的現(xiàn)象，對(duì)于理解miRNA在早期胚胎發(fā)育中的功能和機(jī)制具有重要意義。

圖1 卵母細(xì)胞和早期胚胎中miRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化
       案例（2）人前列腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞小RNA深度測(cè)序展示miRNA的差異類型并首次預(yù)測(cè)靶點(diǎn)生長(zhǎng)因子
       本研究通過(guò)高通量測(cè)序方法對(duì)小RNA長(zhǎng)度進(jìn)行分類，繪制前列腺上皮（PrEC）和間質(zhì)細(xì)胞（PrSC）miRNA圖譜。PrEC測(cè)序共得到近76M reads，其中860468條為特異性序列。PrSC測(cè)序得到近76M reads，其中1百萬(wàn)條為特異性序列。鑒定得到許多高度保守及不保守的miRNA家族。與PrEC相比，16條在PrSC中顯著高表達(dá)的miRNA得到進(jìn)一步分析。結(jié)果表明，這16條miRNA的靶點(diǎn)基因主要涉及附著連接、細(xì)胞附著、EGRF、TGF-β和雄激素信號(hào)。腫瘤抑制Let-7家族miRNA在兩株細(xì)胞中高度表達(dá)。此外，鑒定得到PrEC和PrSC細(xì)胞中特異性表達(dá)的miRNA，預(yù)測(cè)它們的作用靶點(diǎn)為一組轉(zhuǎn)錄因子。

圖1 PrEC和PrSC的小RNA表達(dá)聚類分析



圖2 功能基因重疊


參考文獻(xiàn)
[1] Yang et al. Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos. Science Advances, 2016.
[2] Singh et al. Deep sequencing of small RNA libraries from human prostate epithelial and stromal cells reveal distinct pattern of microRNAs primarily predicted to target growth factors. Cancer Letters, 2016.

miRNA測(cè)序,miRNA測(cè)序

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