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細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程,染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30﹪的染色體DNA在Ca 2+和Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下,在核小體單位之間被隨機切斷,形成180~200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下,將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3’-末端,從而可進行凋亡細胞的檢測,這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂,因而沒有3’-OH形成,很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后,也可使用DNA聚合酶進行缺口翻譯(nick translation),使低分子量的DNA標記或染色,然后分析凋亡細胞。TUNEL或缺口翻譯法實際上是分子生物學與形態(tài)學相結(jié)合的研究方法,對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色,能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學和形態(tài)特征,可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定,并可檢測出極少量的凋亡細胞,靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學測定法要高,因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用。
案例分享:
組織Tunel染色檢測細胞凋亡,組織Tunel染色檢測細胞凋亡
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