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• 產(chǎn)品信息
  
  

  產(chǎn)品名稱	貨號(hào)	規(guī)格
  Annexin V- Alexa Fluor 488/PI Apoptosis Detection Kit   Annexin V- Alexa Fluor 488/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒	40305ES20	20 T
  	40305ES50	50 T
  	40305ES60	100 T

  
  產(chǎn)品描述
  
  

  Annexin V-Alexa Fluor488/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Annexin V-Alexa Fluor488/PI Apoptosis Detection Kit）是用Alexa Fluor488標(biāo)記了的Annexin V作為探針，來檢測細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生，可用流式細(xì)胞儀或其他熒光檢測設(shè)備進(jìn)行檢測。

  其檢測原理為：在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS 從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca²⁺ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。

  另外，本試劑盒中還提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用來區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。PI是一種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時(shí)，PI 則被排除在活細(xì)胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被Alexa Fluor488 和PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+）。

  
  

  產(chǎn)品組分
  
  

   

  編號(hào)	組分	產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格
  		40305ES20（20T）	40305ES50（50T）	40305ES60（100T）
  40305-A	Annexin V-Alexa Fluor488	100 μL	250 μL	500 μL
  40305-B	PI Staining Solution (20 μg/mL)	200 μL	500 μL	1.0 mL
  40305-C	4×Binding Buffer	4 mL	10 mL	20 mL

  
  運(yùn)輸與保存方法
  
  

  冰袋（wet ice）運(yùn)輸。本試劑盒中所有組分均在4℃保存，Annexin V-Alexa Fluor488、PI需避光保存。

  
  注意事項(xiàng)
  
  

  1）由于細(xì)胞凋亡是一個(gè)快速的過程，建議樣品在染色后1小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行分析。

  2）對于貼壁細(xì)胞，消化是一個(gè)關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)如有漂浮細(xì)胞，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。處理貼壁細(xì)胞時(shí)要小心操作，盡量避免人為的損傷細(xì)胞。胰酶消化時(shí)間過短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷，PI攝入過多；消化時(shí)間過長，細(xì)胞膜同樣易造成損傷，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-Alexa Fluor488的結(jié)合。消化時(shí)將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時(shí)胰酶與細(xì)胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時(shí)間，待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會(huì)影響Annexin V與PS的結(jié)合。

  3）如果樣品來源于血液，請務(wù)必除去血液中的血小板。因?yàn)檠“搴蠵S，能與Annexin V結(jié)合，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。可以使用含有EDTA的緩沖劑并在200 g離心洗去血小板。

  4）試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時(shí)液體灑落。

  5）Annexin V-Alexa Fluor488和PI是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)請注意避光。

  
  

  使用說明
  
  

  1.1 樣品染色

  1. 懸浮細(xì)胞：300 g，4℃離心5 min收集細(xì)胞。

  貼壁細(xì)胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300 g，4℃離心5 min收集細(xì)胞。胰酶消化時(shí)間不宜過長，以防引起假陽性。

  2. 配制1×Binding Buffer：用去離子水按1:4 稀釋4×Binding Buffer（4mL 結(jié)合緩沖液+12 mL 去離子水）。

  3. 用4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次均需300g，4℃離心5 min。

  4. 加入250 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×10⁶/mL。

  5. 取100 μL細(xì)胞懸液于5mL流式管中，加入5μL Annexin V-Alexa Fluor 488和10 μL PI，輕輕混勻。

  6. 避光、室溫反應(yīng)15 min。

  7. 加入400 μL PBS，混勻，樣品在1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

  注：為了避免洗滌細(xì)胞時(shí)損失細(xì)胞，在吸液時(shí)可以用大的Tip頭套上小的Tip頭吸液。

  1.2 流式細(xì)胞儀分析

  Alexa Fluor488最大激發(fā)波長為488 nm，最大發(fā)射波長為519 nm；PI-DNA復(fù)合物的最大激發(fā)波長為535 nm，最大發(fā)射波長為615 nm。用CellQuest等軟件進(jìn)行分析，繪制雙色散點(diǎn)圖（two-color dot plot），Alexa Fluor488為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo)。每個(gè)樣采集10，000 events。

  1.3 熒光顯微鏡分析

  1) 滴一滴用Annexin V-FITC/PI雙染的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞。

  2) 在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-FITC熒光信號(hào)呈綠色，PI熒光信號(hào)呈紅色。

   

  HB181205

  
  

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