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Annexin V-PE細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit)是用藻紅蛋白(Phycoerythrin, 簡稱PE)標(biāo)記的重組人Annexin V來檢測細(xì)胞凋亡時出現(xiàn)在細(xì)胞膜表面的磷酯酰絲氨酸的一種細(xì)胞凋亡檢測試劑盒?？梢允褂昧魇郊?xì)胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設(shè)備進(jìn)行檢測。
本試劑盒檢測的是紅色熒光，因此在待檢測的細(xì)胞已經(jīng)表達(dá)GFP等綠色熒光蛋白的情況下，特別適合使用本試劑盒檢測細(xì)胞凋亡。PE可以被495nm、545或564nm的激發(fā)光所激發(fā)，發(fā)出峰值為575nm的熒光。(參考圖1)

圖1.Phycoerythrin的熒光光譜

Annexin是一類廣泛分布于真核細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷酯結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。但僅Annexin V被報道可以調(diào)控一些PKC的活性。
Annexin V選擇性結(jié)合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱PS)。磷酯酰絲氨酸主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會把磷酯酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。磷酯酰絲氨酸暴露到細(xì)胞表面后會促進(jìn)凝血和炎癥反應(yīng)。而Annexin V和外翻到細(xì)胞表面的磷酯酰絲氨酸結(jié)合后可以阻斷磷酯酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。對于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)喪失，Annexin V-PE可以進(jìn)入到細(xì)胞漿內(nèi)，與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光。
用帶有紅色熒光的熒光探針PE標(biāo)記的Annexin V，即Annexin V-PE，就可以用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡非常簡單而直接地檢測到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。
正常細(xì)胞不會被Annexin V-PE所染色，凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞都會被Annexin V-PE所染色。如果希望進(jìn)一步區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞，可以使用其它細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(如C1062 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒)進(jìn)行檢測。使用本試劑盒檢測細(xì)胞凋亡的效果參考圖2。

圖2. Annexin V-PE細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的檢測效果圖。Jurkat細(xì)胞(人T淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞)不處理或用50μM Camptothecin處理3小時后，使用本產(chǎn)品和Hoechst 33342進(jìn)行染色。正常情況下幾乎所有Jurkat細(xì)胞呈Annexin V-PE陰性，只有極少數(shù)的凋亡或壞死細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光(圖B, D)；使用50μM Camptothecin處理Jurkat細(xì)胞3小時，大多數(shù)細(xì)胞呈Annexin V-PE陽性，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜被染成明亮的紅色熒光(圖F, H)。藍(lán)色熒光為Hoechst 33342標(biāo)記的所有細(xì)胞的細(xì)胞核(圖C, G)。本試劑盒中不提供Hoechst 33342，如有需要，可向碧云天訂購C1028 Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(100X)等。實際結(jié)果會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
       本試劑盒小包裝C1065S可以檢測20個樣品，中包裝C1065M可以檢測50個樣品，大包裝C1065L可以檢測100個樣品。
包裝清單：

保存條件：
4℃保存，半年有效。-20℃保存，一年有效。AnnexinV-PE需避光保存。
注意事項：
盡管經(jīng)測試AnnexinV-PE反復(fù)凍融5次對于其檢測效果無顯著影響，但為取得良好的使用效果，3-6個月內(nèi)推薦4℃保存，并適當(dāng)注意避免反復(fù)凍融。
如果有細(xì)菌或真菌污染，會嚴(yán)重影響檢測效果。
染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。
如果細(xì)胞收集過程中使用了胰酶，需注意設(shè)法去除殘留的胰酶。殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-PE，最終導(dǎo)致染色失敗。
由于細(xì)胞樣品的差異、凋亡和壞死程度的差異，可根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果優(yōu)化Annexin V-PE的使用量，進(jìn)行適當(dāng)增加或減少。
熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進(jìn)行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。
需自備PBS。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.  對于懸浮細(xì)胞：
A. 在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后，1000g (約1000-2000rpm)離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)。注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時也起到了洗滌細(xì)胞的作用，可以保證后續(xù)Annexin V-PE的結(jié)合。
B. 取5-10萬重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-PE結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。
C. 加入5μl Annexin V-PE，輕輕混勻。注：由于細(xì)胞樣品的差異、凋亡和壞死程度的差異，可根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果優(yōu)化Annexin V-PE的使用量。
D. 室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善標(biāo)記效果。
E. 隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-PE為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-PE結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。
2.  對于貼壁細(xì)胞：
A. 把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液(可含有EDTA)消化細(xì)胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過度消化。
B. 加入步驟2a中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)。注意：加入步驟2a中的細(xì)胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-PE導(dǎo)致染色失敗。
C. 取5-10萬重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-PE結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。
D. 加入5μl Annexin V-PE，輕輕混勻。注：由于細(xì)胞樣品的差異、凋亡和壞死程度的差異，可根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果優(yōu)化Annexin V-PE的使用量。
E. 室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善標(biāo)記效果。
F. 隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-PE為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-PE結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。L-929細(xì)胞使用本產(chǎn)品的效果參考圖2。
3. 對于貼壁細(xì)胞的原位熒光顯微鏡檢測：
注：本方法的優(yōu)點是可以原位觀察細(xì)胞凋亡，缺點是部分凋亡由于不貼壁而檢測不到。
A. (選做)如果條件許可，把細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板、48孔板或96孔板內(nèi)。在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，用可以對多孔板進(jìn)行離心的離心機(jī)1000g離心5分鐘。
B. 吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌一次。(如果條件許可，在吸除PBS前1000g離心5分鐘。)
C. 加入195μl Annexin V-PE結(jié)合液。
D. 加入5μl Annexin V-PE，輕輕混勻。注：由于細(xì)胞樣品的差異、凋亡和壞死程度的差異，可根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果優(yōu)化Annexin V-PE的使用量。
E. 室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘?？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。
F. 隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-PE為紅色熒光。
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