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Annexin V-PE細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit)是用藻紅蛋白(Phycoerythrin, 簡(jiǎn)稱(chēng)PE)標(biāo)記的重組人Annexin V來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)出現(xiàn)在細(xì)胞膜表面的磷酯酰絲氨酸的一種細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒。可以使用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。
本試劑盒檢測(cè)的是紅色熒光，因此在待檢測(cè)的細(xì)胞已經(jīng)表達(dá)GFP等綠色熒光蛋白的情況下，特別適合使用本試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。PE可以被495nm、545或564nm的激發(fā)光所激發(fā)，發(fā)出峰值為575nm的熒光。(參考圖1)

圖1.Phycoerythrin的熒光光譜

Annexin是一類(lèi)廣泛分布于真核細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子依賴(lài)的磷酯結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。但僅Annexin V被報(bào)道可以調(diào)控一些PKC的活性。
Annexin V選擇性結(jié)合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡(jiǎn)稱(chēng)PS)。磷酯酰絲氨酸主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類(lèi)型的細(xì)胞都會(huì)把磷酯酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。磷酯酰絲氨酸暴露到細(xì)胞表面后會(huì)促進(jìn)凝血和炎癥反應(yīng)。而Annexin V和外翻到細(xì)胞表面的磷酯酰絲氨酸結(jié)合后可以阻斷磷酯酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。對(duì)于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)喪失，Annexin V-PE可以進(jìn)入到細(xì)胞漿內(nèi)，與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光。
用帶有紅色熒光的熒光探針PE標(biāo)記的Annexin V，即Annexin V-PE，就可以用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡非常簡(jiǎn)單而直接地檢測(cè)到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。
正常細(xì)胞不會(huì)被Annexin V-PE所染色，凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞都會(huì)被Annexin V-PE所染色。如果希望進(jìn)一步區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞，可以使用其它細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(如C1062 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒)進(jìn)行檢測(cè)。使用本試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡的效果參考圖2。

圖2. Annexin V-PE細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)效果圖。Jurkat細(xì)胞(人T淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞)不處理或用50μM Camptothecin處理3小時(shí)后，使用本產(chǎn)品和Hoechst 33342進(jìn)行染色。正常情況下幾乎所有Jurkat細(xì)胞呈Annexin V-PE陰性，只有極少數(shù)的凋亡或壞死細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光(圖B, D)；使用50μM Camptothecin處理Jurkat細(xì)胞3小時(shí)，大多數(shù)細(xì)胞呈Annexin V-PE陽(yáng)性，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜被染成明亮的紅色熒光(圖F, H)。藍(lán)色熒光為Hoechst 33342標(biāo)記的所有細(xì)胞的細(xì)胞核(圖C, G)。本試劑盒中不提供Hoechst 33342，如有需要，可向碧云天訂購(gòu)C1028 Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(100X)等。實(shí)際結(jié)果會(huì)因?qū)嶒?yàn)條件、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
       本試劑盒小包裝C1065S可以檢測(cè)20個(gè)樣品，中包裝C1065M可以檢測(cè)50個(gè)樣品，大包裝C1065L可以檢測(cè)100個(gè)樣品。
包裝清單：

保存條件：
4℃保存，半年有效。-20℃保存，一年有效。AnnexinV-PE需避光保存。
注意事項(xiàng)：
盡管經(jīng)測(cè)試AnnexinV-PE反復(fù)凍融5次對(duì)于其檢測(cè)效果無(wú)顯著影響，但為取得良好的使用效果，3-6個(gè)月內(nèi)推薦4℃保存，并適當(dāng)注意避免反復(fù)凍融。
如果有細(xì)菌或真菌污染，會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)效果。
染色后宜盡快檢測(cè)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。
如果細(xì)胞收集過(guò)程中使用了胰酶，需注意設(shè)法去除殘留的胰酶。殘留的胰酶會(huì)消化并降解Annexin V-PE，最終導(dǎo)致染色失敗。
由于細(xì)胞樣品的差異、凋亡和壞死程度的差異，可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化Annexin V-PE的使用量，進(jìn)行適當(dāng)增加或減少。
熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進(jìn)行熒光觀察時(shí)，盡量縮短觀察時(shí)間，同時(shí)在操作和存放過(guò)程中也盡量注意避光保存。
需自備PBS。
本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說(shuō)明：
1.  對(duì)于懸浮細(xì)胞：
A. 在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后，1000g (約1000-2000rpm)離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過(guò)程同時(shí)也起到了洗滌細(xì)胞的作用，可以保證后續(xù)Annexin V-PE的結(jié)合。
B. 取5-10萬(wàn)重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-PE結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。
C. 加入5μl Annexin V-PE，輕輕混勻。注：由于細(xì)胞樣品的差異、凋亡和壞死程度的差異，可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化Annexin V-PE的使用量。
D. 室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。孵育過(guò)程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善標(biāo)記效果。
E. 隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-PE為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測(cè)，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-PE結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。
2.  對(duì)于貼壁細(xì)胞：
A. 把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液(可含有EDTA)消化細(xì)胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來(lái)時(shí)，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過(guò)度消化。
B. 加入步驟2a中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。注意：加入步驟2a中的細(xì)胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會(huì)消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-PE導(dǎo)致染色失敗。
C. 取5-10萬(wàn)重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-PE結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。
D. 加入5μl Annexin V-PE，輕輕混勻。注：由于細(xì)胞樣品的差異、凋亡和壞死程度的差異，可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化Annexin V-PE的使用量。
E. 室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。孵育過(guò)程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善標(biāo)記效果。
F. 隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-PE為紅色熒光。如果用于熒光顯微鏡下檢測(cè)，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-PE結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。L-929細(xì)胞使用本產(chǎn)品的效果參考圖2。
3. 對(duì)于貼壁細(xì)胞的原位熒光顯微鏡檢測(cè)：
注：本方法的優(yōu)點(diǎn)是可以原位觀察細(xì)胞凋亡，缺點(diǎn)是部分凋亡由于不貼壁而檢測(cè)不到。
A. (選做)如果條件許可，把細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板、48孔板或96孔板內(nèi)。在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，用可以對(duì)多孔板進(jìn)行離心的離心機(jī)1000g離心5分鐘。
B. 吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌一次。(如果條件許可，在吸除PBS前1000g離心5分鐘。)
C. 加入195μl Annexin V-PE結(jié)合液。
D. 加入5μl Annexin V-PE，輕輕混勻。注：由于細(xì)胞樣品的差異、凋亡和壞死程度的差異，可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化Annexin V-PE的使用量。
E. 室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘?？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。
F. 隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-PE為紅色熒光。
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