點(diǎn)擊查看說(shuō)明書(shū)

碧云天生產(chǎn)的Phosphate Sensor Assay Kit (磷酸根熒光檢測(cè)試劑盒)，也稱磷酸根傳感器檢測(cè)試劑盒或Phosphate Fluorescent Assay Kit，是一種采用熒光基團(tuán)標(biāo)記的重組磷酸根結(jié)合蛋白，從而可以超高靈敏度檢測(cè)溶液中的無(wú)機(jī)磷酸根或ATP酶(ATPase)、GTP酶(GTPase)，磷酸酶(phosphatase)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase)等酶活性的熒光檢測(cè)試劑盒。

本產(chǎn)品對(duì)于無(wú)機(jī)磷酸根(PO₄^3-)的檢測(cè)靈敏度可以低至100nM。不僅適用于直接檢測(cè)無(wú)機(jī)磷酸根的濃度，也被廣泛用于檢測(cè)能夠直接或間接催化產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷酸根的ATPase，GTPase，phosphatase和phosphodiesterase等酶的活性。

Phosphate Sensor是大腸桿菌(E.coli)磷酸根結(jié)合蛋白(phosphate-binding protein) A197C突變體重組蛋白用環(huán)境敏感型熒光基團(tuán)MDCC (N-[2-(1-Maleimidyl)ethyl]-7-(diethylamino)coumarin-3-carboxamide)進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記的產(chǎn)物。該無(wú)機(jī)磷酸根熒光探針(phosphate fluorescent probe)對(duì)無(wú)機(jī)磷酸根高度敏感，能和無(wú)機(jī)磷酸根快速并緊密(K_d~0.1μM)結(jié)合。無(wú)機(jī)磷酸根的結(jié)合會(huì)引起該傳感器蛋白發(fā)生明顯的構(gòu)象變化，并導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的明顯增強(qiáng)。因此該熒光探針可以用于快速、超高靈敏度對(duì)溶液中的無(wú)機(jī)磷酸根進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)。

Phosphate Sensor與無(wú)機(jī)磷酸根結(jié)合后熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。激發(fā)光波長(zhǎng)為430nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm的條件下，Phosphate Sensor與無(wú)機(jī)磷酸根結(jié)合后熒光信號(hào)增強(qiáng)最為顯著，熒光信號(hào)升高約9倍(圖1)。

圖1. Phosphate Sensor Assay Kit (磷酸根熒光檢測(cè)試劑盒)中Phosphate Sensor結(jié)合無(wú)機(jī)磷酸根前后的熒光信號(hào)差異。檢測(cè)體系(20μl): 5μM Phosphate Sensor, 0或1mM Phosphate Standard，1X檢測(cè)緩沖液。依次將10μl 0或2mM Phosphate Standard和10μl 10μM Phosphate Sensor加入384孔黑板(具體濃度的Phosphate Standard和Phosphate Sensor均由本試劑盒提供的試劑經(jīng)1X檢測(cè)緩沖液稀釋獲得)。采用熒光酶標(biāo)儀在25℃ 430nm激發(fā)光條件下進(jìn)行不同發(fā)射光波長(zhǎng)的熒光測(cè)定，每組實(shí)驗(yàn)體系重復(fù)三次并取平均值。當(dāng)反應(yīng)體系中不加入無(wú)機(jī)磷酸根時(shí)，Phosphate Sensor在430nm激發(fā)光條件下的最大發(fā)射波長(zhǎng)約為474nm；當(dāng)反應(yīng)體系中加入無(wú)機(jī)磷酸根時(shí)，Phosphate Sensor在430nm激發(fā)光條件下的最大發(fā)射波長(zhǎng)約為465nm (圖1A)。當(dāng)激發(fā)光/發(fā)射光分別為430nm/450nm時(shí)，Phosphate Sensor在無(wú)機(jī)磷酸根結(jié)合前后的熒光信號(hào)差異最顯著(圖1B)。

本產(chǎn)品檢測(cè)無(wú)機(jī)磷酸根的敏感范圍約在100nM-5μM之間(圖2)，比傳統(tǒng)的孔雀綠磷酸根檢測(cè)法(Malachite green phosphate assay)敏感約100倍以上。

Phosphate Sensor對(duì)溶液中濃度低至100nM的無(wú)機(jī)磷酸根的結(jié)合即可導(dǎo)致明顯的熒光增強(qiáng)，實(shí)測(cè)的EC₅₀約為1.7μM (圖2)，不同檢測(cè)條件的檢測(cè)數(shù)據(jù)會(huì)略有差異。

圖2. Phosphate Sensor Assay Kit (磷酸根熒光檢測(cè)試劑盒)中Phosphate Sensor結(jié)合無(wú)機(jī)磷酸根的標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測(cè)體系(20μl): 5μM Phosphate Sensor，1X檢測(cè)緩沖液，0-1mM Phosphate Standard。依次將10μl 0-2mM Phosphate Standard和10μl 10μM Phosphate Sensor加入384孔黑板(具體濃度的Phosphate Standard和Phosphate Sensor均由本試劑盒提供的試劑經(jīng)1X檢測(cè)緩沖液稀釋獲得)。采用熒光酶標(biāo)儀在25℃激發(fā)光/發(fā)射光波長(zhǎng)分別為430nm/450nm條件下進(jìn)行熒光測(cè)定，每組實(shí)驗(yàn)體系重復(fù)三次。利用GraphPad Prism軟件中的“variable slope”模型[Y=Bottom+Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))]擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線。不同實(shí)驗(yàn)條件的檢測(cè)數(shù)據(jù)會(huì)略有差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

用途：無(wú)機(jī)磷酸根濃度的超靈敏度熒光檢測(cè)，ATP酶(ATPase)、GTP酶(GTPase)、磷酸酶(Phosphatase)和磷酸二酯酶(Phosphodiesterase)等可以直接或間接催化產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷酸根的酶的高靈敏度活性檢測(cè)。

Phosphate Sensor來(lái)源：MDCC熒光標(biāo)記的E.coli表達(dá)的重組蛋白，表達(dá)基因?yàn)?span style="font-style:italic;">E.coli phoS基因A197C突變體。

本產(chǎn)品在檢測(cè)過(guò)程中操作簡(jiǎn)單，使用方便，通常10-30個(gè)樣品可以在30-60分鐘內(nèi)測(cè)定完畢。

一個(gè)小包裝或中包裝的本產(chǎn)品，其中分別含有20nmol或100nmol的Phosphate Sensor，如果用于20μl檢測(cè)體系，通常分別可以進(jìn)行200或1000次檢測(cè)。

包裝清單：    

保存條件：  
   

-20℃避光保存，至少一年有效。

注意事項(xiàng)：  
   

由于Phosphate Sensor儲(chǔ)存液中含有高濃度甘油，為減小操作誤差，建議根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)所需的量預(yù)先用1X檢測(cè)緩沖液將一定量的Phosphate Sensor稀釋成10μM或其它合適濃度備用。

使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)時(shí)，為避免相鄰孔之間的熒光信號(hào)干擾，推薦使用孔和孔之間不透光的384孔黑板。

某些表面有涂層的多孔板可能含有無(wú)機(jī)磷酸根，容易干擾檢測(cè)體系。因此，建議使用表面未加涂層的384孔黑板進(jìn)行檢測(cè)。

由于不同熒光檢測(cè)設(shè)備的靈敏度有所差異，實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中可以根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整檢測(cè)體系中Phosphate Sensor的終濃度。

檢測(cè)體系中須注意避免引入氣泡，可以在檢測(cè)之前對(duì)檢測(cè)板進(jìn)行離心或震蕩處理。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說(shuō)明：    
    1.樣品中無(wú)機(jī)磷酸根濃度的精確測(cè)定：    
a.試劑的準(zhǔn)備。    
根據(jù)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量，溶解10X檢測(cè)緩沖液，用水配制適量的1X檢測(cè)緩沖液。按照每個(gè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品需要5μl 10μM Phosphate Sensor量，用1X檢測(cè)緩沖液配制適量的10μM Phosphate Sensor。1X檢測(cè)緩沖液配制后可以凍存并用于后續(xù)使用，10μM Phosphate Sensor配制后宜4℃或冰浴保存，并在當(dāng)日使用，不宜凍存并用于后續(xù)使用。Phosphate Sensor的最佳濃度可根據(jù)實(shí)際檢測(cè)效果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。    
b.標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備。    
取適量Phosphate Standard (10mM)，用1X檢測(cè)緩沖液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，例如2mM、1mM、0.5mM、0.25mM、0.125mM、62.5μM、31.3μM、15.6μM、7.8μM……3.9μM、1.95μM、0μM。標(biāo)準(zhǔn)品的濃度范圍和濃度點(diǎn)可以根據(jù)實(shí)際檢測(cè)效果適當(dāng)調(diào)整。    
c.樣品的準(zhǔn)備。    
對(duì)于待檢測(cè)的樣品，根據(jù)預(yù)測(cè)的樣品中的無(wú)機(jī)磷酸根的濃度，用1X檢測(cè)緩沖液將樣品稀釋至無(wú)機(jī)磷酸根的濃度約在200nM-2μM范圍，每個(gè)樣品的體積不少于10μl。    
d.標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的檢測(cè)。    
(a)參考下表設(shè)置反應(yīng)體系。使用384孔黑板，先加入10μl 10μM Phosphate Sensor，再加入10μl不同濃度的上述Phosphate Standard溶液或待檢測(cè)的樣品，充分混勻后進(jìn)行熒光測(cè)定。檢測(cè)條件為25℃，激發(fā)光/發(fā)射光=430nm/450nm。為減小誤差，每組實(shí)驗(yàn)體系最好能重復(fù)三次。    
   

(b)利用GraphPad Prism軟件中的“variable slope”模型[Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))]擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合之前需先將Phosphate濃度“X”轉(zhuǎn)換成“l(fā)og(X)”。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的無(wú)機(jī)磷酸根的濃度。    
    2.樣品中催化生成無(wú)機(jī)磷酸根的酶活性檢測(cè)。    
a.終點(diǎn)法酶活性檢測(cè)。    
(a)參考文獻(xiàn)資料，針對(duì)具體的酶，例如ATPase，GTPase，Phosphatase和phosphodiesterase等設(shè)置相應(yīng)的酶反應(yīng)體系。    
(b)反應(yīng)結(jié)束后，參考上述步驟1c，用1X檢測(cè)緩沖液稀釋樣品至無(wú)機(jī)磷酸根濃度約在200nM-2μM范圍，每個(gè)樣品的體積不少于10μl。    
(c)同上述步驟1，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的檢測(cè)。    
(d)根據(jù)樣品和對(duì)照中檢測(cè)出的無(wú)機(jī)磷酸根的濃度，和相應(yīng)的酶活性定義，計(jì)算出樣品中的酶活性。如果有必要可以檢測(cè)樣品的蛋白濃度，以計(jì)算出單位蛋白含量樣品中的酶活性。    
b.酶活性的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)。    
(a)參考文獻(xiàn)資料，針對(duì)具體的酶，例如ATPase，GTPase，Phosphatase和phosphodiesterase等規(guī)劃相應(yīng)的酶反應(yīng)體系。推薦反應(yīng)體系的最終體積為20μl，并在384孔黑板中進(jìn)行反應(yīng)。    
(b)在酶反應(yīng)體系中加入Phosphate Sensor至終濃度為5μM。    
(c)加入ATPase等酶的關(guān)鍵底物起始酶反應(yīng)。    
(d)每間隔適當(dāng)時(shí)間進(jìn)行熒光檢測(cè)，激發(fā)光/發(fā)射光=430nm/450nm。    
(e)根據(jù)樣品和對(duì)照在不同時(shí)間點(diǎn)的熒光讀數(shù)，以及參考步驟1進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算出在單位時(shí)間內(nèi)樣品中酶催化產(chǎn)生的無(wú)機(jī)磷酸根的量。然后再根據(jù)酶的活性定義，計(jì)算出樣品中酶活性。如果有必要可以檢測(cè)樣品的蛋白濃度，以計(jì)算出單位蛋白含量樣品中的酶活性。