點擊查看說明書

碧云天生產(chǎn)的Phosphate Sensor Assay Kit (磷酸根熒光檢測試劑盒)，也稱磷酸根傳感器檢測試劑盒或Phosphate Fluorescent Assay Kit，是一種采用熒光基團標記的重組磷酸根結(jié)合蛋白，從而可以超高靈敏度檢測溶液中的無機磷酸根或ATP酶(ATPase)、GTP酶(GTPase)，磷酸酶(phosphatase)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase)等酶活性的熒光檢測試劑盒。

本產(chǎn)品對于無機磷酸根(PO₄^3-)的檢測靈敏度可以低至100nM。不僅適用于直接檢測無機磷酸根的濃度，也被廣泛用于檢測能夠直接或間接催化產(chǎn)生無機磷酸根的ATPase，GTPase，phosphatase和phosphodiesterase等酶的活性。

Phosphate Sensor是大腸桿菌(E.coli)磷酸根結(jié)合蛋白(phosphate-binding protein) A197C突變體重組蛋白用環(huán)境敏感型熒光基團MDCC (N-[2-(1-Maleimidyl)ethyl]-7-(diethylamino)coumarin-3-carboxamide)進行化學標記的產(chǎn)物。該無機磷酸根熒光探針(phosphate fluorescent probe)對無機磷酸根高度敏感，能和無機磷酸根快速并緊密(K_d~0.1μM)結(jié)合。無機磷酸根的結(jié)合會引起該傳感器蛋白發(fā)生明顯的構(gòu)象變化，并導致熒光強度的明顯增強。因此該熒光探針可以用于快速、超高靈敏度對溶液中的無機磷酸根進行實時動力學檢測。

Phosphate Sensor與無機磷酸根結(jié)合后熒光信號顯著增強。激發(fā)光波長為430nm，發(fā)射光波長為450nm的條件下，Phosphate Sensor與無機磷酸根結(jié)合后熒光信號增強最為顯著，熒光信號升高約9倍(圖1)。

圖1. Phosphate Sensor Assay Kit (磷酸根熒光檢測試劑盒)中Phosphate Sensor結(jié)合無機磷酸根前后的熒光信號差異。檢測體系(20μl): 5μM Phosphate Sensor, 0或1mM Phosphate Standard，1X檢測緩沖液。依次將10μl 0或2mM Phosphate Standard和10μl 10μM Phosphate Sensor加入384孔黑板(具體濃度的Phosphate Standard和Phosphate Sensor均由本試劑盒提供的試劑經(jīng)1X檢測緩沖液稀釋獲得)。采用熒光酶標儀在25℃ 430nm激發(fā)光條件下進行不同發(fā)射光波長的熒光測定，每組實驗體系重復三次并取平均值。當反應體系中不加入無機磷酸根時，Phosphate Sensor在430nm激發(fā)光條件下的最大發(fā)射波長約為474nm；當反應體系中加入無機磷酸根時，Phosphate Sensor在430nm激發(fā)光條件下的最大發(fā)射波長約為465nm (圖1A)。當激發(fā)光/發(fā)射光分別為430nm/450nm時，Phosphate Sensor在無機磷酸根結(jié)合前后的熒光信號差異最顯著(圖1B)。

本產(chǎn)品檢測無機磷酸根的敏感范圍約在100nM-5μM之間(圖2)，比傳統(tǒng)的孔雀綠磷酸根檢測法(Malachite green phosphate assay)敏感約100倍以上。

Phosphate Sensor對溶液中濃度低至100nM的無機磷酸根的結(jié)合即可導致明顯的熒光增強，實測的EC₅₀約為1.7μM (圖2)，不同檢測條件的檢測數(shù)據(jù)會略有差異。

圖2. Phosphate Sensor Assay Kit (磷酸根熒光檢測試劑盒)中Phosphate Sensor結(jié)合無機磷酸根的標準曲線。檢測體系(20μl): 5μM Phosphate Sensor，1X檢測緩沖液，0-1mM Phosphate Standard。依次將10μl 0-2mM Phosphate Standard和10μl 10μM Phosphate Sensor加入384孔黑板(具體濃度的Phosphate Standard和Phosphate Sensor均由本試劑盒提供的試劑經(jīng)1X檢測緩沖液稀釋獲得)。采用熒光酶標儀在25℃激發(fā)光/發(fā)射光波長分別為430nm/450nm條件下進行熒光測定，每組實驗體系重復三次。利用GraphPad Prism軟件中的“variable slope”模型[Y=Bottom+Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))]擬合出標準曲線。不同實驗條件的檢測數(shù)據(jù)會略有差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

用途：無機磷酸根濃度的超靈敏度熒光檢測，ATP酶(ATPase)、GTP酶(GTPase)、磷酸酶(Phosphatase)和磷酸二酯酶(Phosphodiesterase)等可以直接或間接催化產(chǎn)生無機磷酸根的酶的高靈敏度活性檢測。

Phosphate Sensor來源：MDCC熒光標記的E.coli表達的重組蛋白，表達基因為E.coli phoS基因A197C突變體。

本產(chǎn)品在檢測過程中操作簡單，使用方便，通常10-30個樣品可以在30-60分鐘內(nèi)測定完畢。

一個小包裝或中包裝的本產(chǎn)品，其中分別含有20nmol或100nmol的Phosphate Sensor，如果用于20μl檢測體系，通常分別可以進行200或1000次檢測。

包裝清單：    

保存條件：  
   

-20℃避光保存，至少一年有效。

注意事項：  
   

由于Phosphate Sensor儲存液中含有高濃度甘油，為減小操作誤差，建議根據(jù)每次實驗所需的量預先用1X檢測緩沖液將一定量的Phosphate Sensor稀釋成10μM或其它合適濃度備用。

使用熒光酶標儀檢測時，為避免相鄰孔之間的熒光信號干擾，推薦使用孔和孔之間不透光的384孔黑板。

某些表面有涂層的多孔板可能含有無機磷酸根，容易干擾檢測體系。因此，建議使用表面未加涂層的384孔黑板進行檢測。

由于不同熒光檢測設備的靈敏度有所差異，實際檢測過程中可以根據(jù)熒光信號的強弱適當調(diào)整檢測體系中Phosphate Sensor的終濃度。

檢測體系中須注意避免引入氣泡，可以在檢測之前對檢測板進行離心或震蕩處理。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：    
    1.樣品中無機磷酸根濃度的精確測定：    
a.試劑的準備。    
根據(jù)樣品和標準品的數(shù)量，溶解10X檢測緩沖液，用水配制適量的1X檢測緩沖液。按照每個樣品或標準品需要5μl 10μM Phosphate Sensor量，用1X檢測緩沖液配制適量的10μM Phosphate Sensor。1X檢測緩沖液配制后可以凍存并用于后續(xù)使用，10μM Phosphate Sensor配制后宜4℃或冰浴保存，并在當日使用，不宜凍存并用于后續(xù)使用。Phosphate Sensor的最佳濃度可根據(jù)實際檢測效果進行適當調(diào)整。    
b.標準品的準備。    
取適量Phosphate Standard (10mM)，用1X檢測緩沖液稀釋成不同濃度的標準品，例如2mM、1mM、0.5mM、0.25mM、0.125mM、62.5μM、31.3μM、15.6μM、7.8μM……3.9μM、1.95μM、0μM。標準品的濃度范圍和濃度點可以根據(jù)實際檢測效果適當調(diào)整。    
c.樣品的準備。    
對于待檢測的樣品，根據(jù)預測的樣品中的無機磷酸根的濃度，用1X檢測緩沖液將樣品稀釋至無機磷酸根的濃度約在200nM-2μM范圍，每個樣品的體積不少于10μl。    
d.標準品和樣品的檢測。    
(a)參考下表設置反應體系。使用384孔黑板，先加入10μl 10μM Phosphate Sensor，再加入10μl不同濃度的上述Phosphate Standard溶液或待檢測的樣品，充分混勻后進行熒光測定。檢測條件為25℃，激發(fā)光/發(fā)射光=430nm/450nm。為減小誤差，每組實驗體系最好能重復三次。    
   

(b)利用GraphPad Prism軟件中的“variable slope”模型[Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))]擬合出標準曲線，擬合之前需先將Phosphate濃度“X”轉(zhuǎn)換成“l(fā)og(X)”。根據(jù)標準曲線計算出樣品中的無機磷酸根的濃度。    
    2.樣品中催化生成無機磷酸根的酶活性檢測。    
a.終點法酶活性檢測。    
(a)參考文獻資料，針對具體的酶，例如ATPase，GTPase，Phosphatase和phosphodiesterase等設置相應的酶反應體系。    
(b)反應結(jié)束后，參考上述步驟1c，用1X檢測緩沖液稀釋樣品至無機磷酸根濃度約在200nM-2μM范圍，每個樣品的體積不少于10μl。    
(c)同上述步驟1，設置標準曲線，并進行標準品和樣品的檢測。    
(d)根據(jù)樣品和對照中檢測出的無機磷酸根的濃度，和相應的酶活性定義，計算出樣品中的酶活性。如果有必要可以檢測樣品的蛋白濃度，以計算出單位蛋白含量樣品中的酶活性。    
b.酶活性的動力學檢測。    
(a)參考文獻資料，針對具體的酶，例如ATPase，GTPase，Phosphatase和phosphodiesterase等規(guī)劃相應的酶反應體系。推薦反應體系的最終體積為20μl，并在384孔黑板中進行反應。    
(b)在酶反應體系中加入Phosphate Sensor至終濃度為5μM。    
(c)加入ATPase等酶的關鍵底物起始酶反應。    
(d)每間隔適當時間進行熒光檢測，激發(fā)光/發(fā)射光=430nm/450nm。    
(e)根據(jù)樣品和對照在不同時間點的熒光讀數(shù)，以及參考步驟1進行的標準曲線檢測結(jié)果，計算出在單位時間內(nèi)樣品中酶催化產(chǎn)生的無機磷酸根的量。然后再根據(jù)酶的活性定義，計算出樣品中酶活性。如果有必要可以檢測樣品的蛋白濃度，以計算出單位蛋白含量樣品中的酶活性。