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Product Brief

• 產(chǎn)品概況

  產(chǎn)品貨號	MK1016
  產(chǎn)品名稱	TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒-CY3（50T）
  保存條件	-20℃冷凍保存，一年有效。
  工作原理	在機體內(nèi)部隨時都在發(fā)生著細胞的死亡。傳統(tǒng)上用顯微鏡來觀察細胞的死亡，其特征為核染色質(zhì)的濃縮及碎片的形成。但是這種現(xiàn)象出現(xiàn)的很晚，時間也很短暫。凋亡的特征是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細胞自身的染色質(zhì)或DNA被切割，出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口，并產(chǎn)生與DNA斷點數(shù)目相同的3’-OH末端。末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase )可以將地高辛標記的dUTP(DIG-dUTP)標記至3’-OH末端，DIG-dUTP結(jié)合在DNA斷點部位，可以通過生物標記的抗地高辛抗體(Anti-DIG-Biotin)反應后，再結(jié)合鏈酶親和素-熒光素CY3(SABC-CY3)。Cy3 在554nm 激化，在568-574nm 發(fā)射熒光，呈鮮紅色，從而可以在顯微鏡下觀察到著色的凋亡細胞。
  試劑盒內(nèi)容	1. 標記緩沖液(Labeling Buffer)                         3ml 2. 末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT,×20)                50μι 3. DIG-dUTP (×20)                                           50μι 4. 封閉液(Blocking Reagent)                            10ml 5. 生物素化抗地高辛抗體(× 100)                       50μι 6. SABC-CY3 (× 100)                                       50μι 7. Proteinase K (×200)                                    125μι 8.抗體稀釋液                                                    10ml 9.陽性對照片                                                    2 張

  
  

Instructions

用戶自備試劑

1. 多聚賴氨酸或APES(博士德公司有售)。
2. 0.01M TBS,pH7.5 (配法:1L 雙蒸餾水中加入8.5 克氯化鈉,1.2 克Tris 和0.45—0.5ml 純乙酸)。
3. 水溶性封片劑或熒光衰減封片劑（博士德公司有售)。
4. DAPI染色液(貨號AR1176，AR1177)。

操作步驟

1. 樣品處理
(1) 玻片預先用多聚賴氨酸或APES 進行處理。
(2) 細胞涂片和冰凍切片：最重要的是及時固定。用4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0—7.6)室溫下固定30—60 分鐘。0.01M PBS 洗2 分鐘×2 次。蒸餾水洗滌2 分鐘×2 次。
(3) 組織：有條件時應及時固定。常規(guī)4%多聚甲醛/0.01M PBS (pH7.0—7.6)或10%中性緩沖福爾馬林固定4 小時以上，石蠟包埋。切片常規(guī)脫蠟入水(脫蠟務必干凈)。
2. 標本片加0.01M TBS 1:200 新鮮稀釋Proteinase K 37℃消化1—15 分鐘,0.01M TBS 洗2 分鐘×3次。(細胞涂片和冰凍切片一般不消化或消化10—60 秒鐘。新鮮石蠟切片消化5-10 分鐘。陳舊石蠟切片消化10-15 分鐘)。
3. 標本片加標記緩沖液(Labeling Buffer) 20μι/片,以保持切片濕潤。按每張切片取TdT和DIG-d-UTP 各1μι，加入18μι標記緩沖液中，混勻。甩去切片上多余液體后加標記液，20μι/片。置樣品于濕盒中，37℃標記2 小時。
4. 0.01M TBS 洗2 分鐘×3 次。
5. 加封閉液50μι/片，室溫30 分鐘，甩掉封閉液，不洗。
6. 用抗體稀釋液1：100稀釋生物素化抗地高辛抗體：(取1ml 抗體稀釋液加生物素化抗地高辛抗體10μι)，混勻后50μι/片加至標本片上。置樣品于濕盒中，37℃反應30 分鐘。0.01M TBS洗2 分鐘×3 次。
7. 用抗體稀釋液1：100稀釋SABC-FITC：取1ml 抗體稀釋液加SABC 10μι，混勻后50μι/片加至切片。37℃反應30 分鐘。0.01M TBS 洗5 分鐘×4 次。
8. 必要時可用DAPI染色液(貨號AR1176或AR1177)輕度復染，蒸餾水洗?？篃晒馑p封片劑封片。熒光顯微鏡觀察。

結(jié)果判定

細胞核中有鮮紅色熒光顆粒為陽性細胞，即凋亡的細胞。

注意事項

1. 試劑盒嚴格-20℃存放。
2.初用時如試管底部無可見的試劑，在離心機離心5 分鐘，使試劑沉至管底。
3.檢測過程中切勿使樣品干涸。