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Product Brief

• 產(chǎn)品概況

  產(chǎn)品貨號(hào)	MK1025
  產(chǎn)品名稱(chēng)	TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒-POD（100T）
  保存條件	-20℃冷凍保存，一年有效。
  工作原理	在機(jī)體內(nèi)部隨時(shí)都在發(fā)生著細(xì)胞的死亡。傳統(tǒng)上用顯微鏡來(lái)觀察細(xì)胞的死亡，其特征為核染色質(zhì)的濃縮及碎片的形成。但是這種現(xiàn)象出現(xiàn)的很晚，時(shí)間也很短暫。凋亡的特征是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細(xì)胞自身的染色質(zhì)或DNA 被切割，出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口，并產(chǎn)生與DNA 斷點(diǎn)數(shù)目相同的3’-OH 末端。末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase )可以將地高辛標(biāo)記的dUTP (DIG-dUTP)標(biāo)記至3’-OH 末端，DIG-dUTP 結(jié)合在DNA 斷點(diǎn)部位，可以通過(guò)生物標(biāo)記的抗地高辛抗體(Anti-DIG-Biotin)反應(yīng)后，再結(jié)合鏈酶親和素-過(guò)氧化物酶(SABC)，然后加入顯色底物DAB 予以顯示。凋亡的細(xì)包核呈黃色，從而可以在顯微鏡下觀察到著色的凋亡細(xì)胞。
  試劑盒內(nèi)容	1. 標(biāo)記緩沖液(Labeling Buffer) 5ml 2. 末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT,×20) 100μι 3. DIG-dUTP (×20) 100μι 4. 封閉液(Blocking Reagent) 20ml 5. 生物素化抗地高辛抗體(× 100) 100μι 6. SABC (× 100) 100μι 7. Proteinase K (×200) 250μι 8. 抗體稀釋液20ml 9. 陽(yáng)性對(duì)照片2 張

  
  

Instructions

用戶(hù)自備試劑

1. 多聚賴(lài)氨酸或APES(博士德公司有售)。
2. 0.01M TBS,pH7.5(配法:1L 雙蒸餾水中加入8.5 克氯化鈉,1.2 克Tris 和0.45—0.5ml 純乙酸。)
3. DAB 顯色試劑盒(博士德公司有售)，也可自配顯色劑。

操作步驟

1. 樣品處理
(1) 玻片預(yù)先用多聚賴(lài)氨酸或APES 進(jìn)行處理。
(2) 細(xì)胞涂片和冰凍切片：最重要的是及時(shí)固定。用4%多聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0—7.6)室溫下固定30—60 分鐘。0.01M PBS 洗2 分鐘×2 次。蒸餾水洗滌2 分鐘×2 次。
(3) 組織：有條件時(shí)應(yīng)及時(shí)固定。常規(guī)4%多聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0—7.6)或10%中性緩沖福爾馬林固定4 小時(shí)以上，石蠟包埋。切片常規(guī)脫蠟入水(脫蠟務(wù)必干凈)。
2. 新鮮配制3%H2O2，室溫處理10 分鐘。蒸餾水洗滌2 分鐘×3 次。
3. 標(biāo)本片加0.01M TBS 1:200 新鮮稀釋Proteinase K 37℃消化1—15 分鐘,0.01M TBS 洗2 分鐘×3次。(細(xì)胞涂片和冰凍切片一般不消化或消化10—60 秒鐘。新鮮石蠟切片消化5-10 分鐘。陳舊石蠟切片消化10-15 分鐘)。
4. 標(biāo)本片加標(biāo)記緩沖液(Labeling Buffer) 20μι/片,以保持切片濕潤(rùn)。按每張切片取TdT和DIG-d-UTP 各1μι，加入18μι標(biāo)記緩沖液中，混勻。甩去切片上多余液體后加標(biāo)記液，20μι/片。置樣品于濕盒中，37℃標(biāo)記2 小時(shí)。
5. 0.01M TBS 洗2 分鐘×3 次。
6. 加封閉液50μι/片，室溫30 分鐘，甩掉封閉液，不洗。
7. 用抗體稀釋液1：100稀釋生物素化抗地高辛抗體：(取1ml 抗體稀釋液加生物素化抗地高辛抗體10μι)，混勻后50μι/片加至標(biāo)本片上。置樣品于濕盒中，37℃反應(yīng)30 分鐘。0.01M TBS洗2 分鐘×3 次。
8. 用抗體稀釋液1：100稀釋SABC：取1ml 抗體稀釋液加SABC 10μι，混勻后50μι/片加至切片。37℃反應(yīng)30 分鐘。0.01M TBS 洗5 分鐘×4 次。
9. DAB 顯色：取1ml 蒸餾水，分別加入DAB 試劑盒中A，B，C 試劑各一滴，混勻后加至標(biāo)本片上，顯色10-30 分鐘左右。水洗。
10. 蘇木素輕度復(fù)染。0.01M TBS 洗，蒸餾水洗。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。

結(jié)果判定

細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡的細(xì)胞。

注意事項(xiàng)

1.試劑盒嚴(yán)格-20℃存放。
2.初用時(shí)如試管底部無(wú)可見(jiàn)的試劑，在離心機(jī)離心5 分鐘，使試劑沉至管底。
3.檢測(cè)過(guò)程中切勿使樣品干涸。