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Product Brief

• 產(chǎn)品概況

  產(chǎn)品貨號	MK1027
  產(chǎn)品名稱	TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒-FITC（100T）
  保存條件	-20℃冷凍保存，一年有效。
  工作原理	在機體內(nèi)部隨時都在發(fā)生著細胞的死亡。傳統(tǒng)上用顯微鏡來觀察細胞的死亡，其特征為核染色質(zhì)的濃縮及碎片的形成。但是這種現(xiàn)象出現(xiàn)的很晚，時間也很短暫。凋亡的特征是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細胞自身的染色質(zhì)或DNA被切割，出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口，并產(chǎn)生與DNA斷點數(shù)目相同的3’-OH末端。末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal deoxynucleotidyl Transferase ）可以將地高辛標(biāo)記的dUTP （DIG-dUTP）標(biāo)記至3’-OH末端，DIG-dUTP結(jié)合在DNA斷點部位，可以通過生物標(biāo)記的抗地高辛抗體（Anti-DIG-Biotin）反應(yīng)后，再結(jié)合鏈酶親和素-熒光素FITC（SABC-FITC）。FITC在490-495nm激化，在520-530nm發(fā)射熒光，呈黃綠色。凋亡的細胞核呈黃綠色，從而可以在顯微鏡下觀察到著色的凋亡細胞。
  試劑盒內(nèi)容	1. 標(biāo)記緩沖液(Labeling Buffer)          5ml 2. 末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT,×20) 100μι 3. DIG-dUTP (×20)                            100μι 4. 封閉液(Blocking Reagent)              20ml 5. 生物素化抗地高辛抗體(× 100)         100μι 6. SABC-FITC(×100)                           100μι 7. Proteinase K (×200)                       250μι 8. 抗體稀釋液                                      20ml 9. 陽性對照片                                      2 張

  
  

Instructions

用戶自備試劑

1. 多聚賴氨酸或APES(博士德公司有售)。

2. 0.01M TBS,PH7.5(配法:1L雙蒸餾水中加入8.5克氯化鈉,1.2克Tris 和0.45—0.5ml純乙酸。)

3. DAPI染色液（貨號AR1176，AR1177）

4. 水溶性封片劑或抗熒光衰減封片劑。

操作步驟

1. 樣品處理

(1) 玻片預(yù)先用多聚賴氨酸或APES進行處理。

(2) 細胞涂片和冰凍切片：最重要的是及時固定。用4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)室溫下固定30—60分鐘。0.01M PBS洗2分鐘×2次。蒸餾水洗滌2分鐘×2次。

(3) 組織：有條件時應(yīng)及時固定。常規(guī)4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)或10%中性緩沖福爾馬林固定4小時以上，石蠟包埋。切片常規(guī)脫蠟入水（脫蠟務(wù)必干凈）。

2. 標(biāo)本片加0.01M TBS 1:200新鮮稀釋Proteinase K 37℃消化1—15分鐘,0.01M TBS洗2分鐘×3次。(細胞涂片和冰凍切片一般不消化或消化10—60秒鐘。新鮮石蠟切片消化5-10分鐘。陳舊石蠟切片消化10-15分鐘)。

3. 標(biāo)本片加標(biāo)記緩沖液(Labeling Buffer) 20μι/片,以保持切片濕潤。按每張切片取TdT和DIG-d-UTP各1μι，加入18μι標(biāo)記緩沖液中，混勻。甩去切片上多余液體后加標(biāo)記液，20μι/片。置樣品于濕盒中，37℃標(biāo)記2小時。

4. 0.01M TBS洗2分鐘×3次。

5. 加封閉液50μι/片，室溫30分鐘，甩掉封閉液，不洗。

6. 用抗體稀釋液1：100稀釋生物素化抗地高辛抗體：（取1ml抗體稀釋液加生物素化抗地高辛抗體10μι），混勻后50μι/片加至標(biāo)本片上。置樣品于濕盒中，37℃反應(yīng)30分鐘。0.01M TBS洗2分鐘×3次。

7. 用抗體稀釋液1：100稀釋SABC：取1ml抗體稀釋液加SABC 10μι，混勻后50μι/片加至切片。37℃反應(yīng)30分鐘。0.01M TBS洗5分鐘×4次。

8. 必要時可用DAPI染色液（貨號AR1176，AR1177）輕度復(fù)染，蒸餾水洗?？篃晒馑p封片劑封片(可用甘油代替)。熒光顯微鏡觀察。

結(jié)果判定

細胞核中有黃綠色顆粒者為陽性細胞，即凋亡的細胞。

注意事項

1. 試劑盒嚴格-20℃存放。

2. 初用時如試管底部無可見的試劑，在離心機離心5分鐘，使試劑沉至管底。

3. 檢測過程中切勿使樣品干涸。